章鱼肉碱标准样品的研制（一）

  章鱼肉碱标准样品。以章鱼加工副产物为原料， 通过提取、 分离纯化制备高纯章鱼肉碱， 采用红外光谱(IR)、 高分辨质谱 (MS) 和核磁共振谱 (NMR) 进行结构确证。样品分装成 144 瓶， 采用离子色谱检测法进行均匀性、 稳定性检验和定值分析。从样品中随机抽取 15 瓶进行均匀性检验， 经 F 检验表明： 在 95% 的置信区间内样品均匀性良好。在 0～4℃条件下， 经过 24 个月长期试验稳定性考察， 结果表明样品稳定性良好。标准样品经国内 8 家具有分析资质的实验室进行协同定值， 章鱼肉碱标准样品定值结果为 99.49%， 相对扩展不确定度为 0.14%(k=1.96)。该标准样品达到标准样品的技术要求， 可用于章鱼肉碱相关产品的质量控制和分析方法校正。

  Development of Octopine Certified Reference Material

  Octopine certified reference material was developed. Octopine was made from the processing byproduct of octopus. The structure of octopine certified reference material was comfirmed by infrared spectroscopy (IR)， high resolution mass spectral (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR). Octopine was divided into 144 bottles. The homogeneity and stability testing and quantitative analysis method were evaluated by ions chromatography. According to analysis procedure of homogeneity， 15 bottles of sample were randomly taken from 144 bottles， the sample homogeneity of inspection validated by F–test statistical methods within the 95% confidence interval was good. The stability inspection was carried on the long-term(24 months)， and the results indicated that the period for octopine of storage was 24 months at 0 – 4℃ . A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of octopine was 99.49% with the relative expaned uncertainty of 0.14 % (k=1.96). The reference material can conform to the technical requirement of the certified reference material. The material was intended for use in the method validation and quality control regarding octopine.

  章鱼肉碱 (Octopine) 又名章鱼碱， 在自然界中主要存在于章鱼、 乌贼、 鱿鱼、 扇贝等海产软体动物中， 由精氨酸与丙氨酸或丙酮酸在酶的作用下缩合而成， 具有重要的生物活性功能。研究发现， 章鱼肉碱是导致章鱼、 扇贝等味道鲜美的原因之一； 章鱼肉碱有助于降低小鼠血液中总胆固醇和VLDL， LDL 胆固醇的水平， 同时增加小鼠血液中HDL 胆固醇水平； 对比研究揭示喂食章鱼肉碱可显著提高小白鼠的交尾次数及妊娠概率。 此外，章鱼肉碱还是一种表征品质和新鲜度的指示剂，可以应用于食品质量监控及安全等方面。目前， 国内外未见章鱼肉碱标准样品研制的报道。笔者以章鱼加工副产物为原料， 通过提取、 分离纯化获得高纯章鱼肉碱单体， 研制了标准样品， 为深入开展相关研究提供物质基础。

  1. 实验部分

  1.1  主要仪器与试剂

  离子色谱仪： Dionex ICS–3000 型， 配备积分脉冲安培检测器， 美国 Dionex 公司；

  红外光谱仪： Bruker VERTEX 70 型，美 国Bruker 公司；

  高分辨质谱仪： Q–Tof micro 型， 美国 Waters 公司；

  核磁共振仪： Bruker 400 MHz 型， 美国 Bruker公司；

  天平： AL／104 型， 瑞士梅特勒 – 托利多集团；

  盐酸、 醋酸钠、 氢氧化钠： 分析纯；

  实验用水来自 Milli-Q 纯水系统。

  1.2  章鱼肉碱样品的制备

  以章鱼加工副产物为原料， 经浸提、 膜分离等步骤后获得粗品， 再采用色谱分离、 浓缩、 干燥等精制方法获得纯度不小于 99% 的章鱼肉碱。

  1.3  定性与定值分析

  采用红外吸收光谱、 高分辨质谱及核磁共振谱等对章鱼肉碱标准样品进行定性分析。采用离子色谱法对章鱼肉碱样品定值检测。

  1.4  色谱条件

  色谱柱： Dionex AminoPac PA–10柱(250 mm×2mm， 10 µm，美 国 Dionex 公 司 ) ；柱 流 量： 0.24mL／min ； 柱温： 30℃； 进样体积： 25 µL ； 流动相：A 为 水， B 为 250 mmol／L NaOH 溶 液， C 为 1.0mol／L NaOAc， 进行梯度洗脱， 洗脱程序见表 1。

  1.5  样品溶液配制

打开章鱼肉碱样品瓶盖子后， 精密称取章鱼肉碱适量， 用超纯水配制成章鱼肉碱质量浓度约为 8µg／mL 的溶液， 按照 1.4 色谱条件进行纯度检测，每个样品重复进样 3 次。

  1.6  均匀性检验

  按照 GB／T 15000.3–2008规定， 本项目确定抽样数目为 15 个， 采用单因素多水平试验方差分析法对章鱼肉碱标准样品进行纯度均匀性检验， 测定方法采用上述的离子色谱检测法， 每个样品重复测3 次。检测数据用方差分析法进行分析以判断标准样品的均匀性是否合格。

  1.7  稳定性检验

  为了考察样品的稳定性， 确定其有效期， 取本标准样品模拟上市包装， 进行 0～4℃条件下的 24 个月长期试验， 分别于 0， 3， 6， 9， 12， 18， 24 个月末取样检测， 通过考察标准样品纯度的变化来研究样品的稳定性。采用上述离子色谱检测法， 每份样品连续进样 2 次， 然后用归一法求出其纯度的平均值。